探針設(shè)計的原則具體體現(xiàn)如下：

1. 先選擇好探針，然后設(shè)計引物使其盡可能的靠近探針。

2. 所選序列應(yīng)該高度特異，盡量選擇具有最小二級結(jié)構(gòu)的擴增片段——這是因為二級結(jié)構(gòu)會影響反應(yīng)效率，而且還會阻礙酶的擴增。建議先進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)檢測，如果不能避免二級結(jié)構(gòu)，那么就要相應(yīng)提高退火溫度。

3. 擴增長度應(yīng)不超過400bp，理想的擴增長度在100-150bp內(nèi)，擴增片段越短，有效的擴增反應(yīng)就越容易獲得。較短的擴增片段也容易保證分析的一致性。

4. 保持GC含量在20％和80％之間，GC富含區(qū)容易產(chǎn)生非特異反應(yīng)，從而會導(dǎo)致擴增效率的降低，以及出現(xiàn)在熒光染料分析中非特異信號。

5. 為了保證效率和重復(fù)性，應(yīng)避免重復(fù)的核苷酸序列，尤其是G（不能有4個連續(xù)的G） 。

6. 將引物和探針互相進(jìn)行配對檢測，以避免二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成。

在原理上與引物設(shè)計是比較類似的。只是因為探針序列要求匹配度很高，所以對于探針的GC含量和Tm值都是有嚴(yán)格要求的，而且還要考慮到與上下游引物相匹配。假如你手頭已經(jīng)有了染料法的引物，然后想仍然使用這一對引物、在這一對引物對應(yīng)的序列中間選一段作為探針可以嗎？我們不建議這么做。因為你單獨設(shè)計的上下游引物沒問題，單獨設(shè)計的探針看起來也沒問題，但把引物與探針放在一起，就有可能出現(xiàn)參數(shù)不兼容的問題。所以還是三者放在一起設(shè)計才好。